Kalkulator Ligation

Kategoria: Biologi
- April 04, 2025
| |

DNA Vektor

DNA Sisipan

Pengaturan Reaksi Ligation

Jumlah Sisipan yang Direkomendasikan
8.3 ng
0.33 μL dari stok sisipan
Jumlah Vektor
50 ng
Menggunakan 1 μL dari stok vektor
Rasio Sisipan:Vektor
3:1 (molar)
Optimal untuk kloning standar

Pengaturan Reaksi Lengkap

Komponen Volume (μL) Jumlah Akhir
DNA Vektor (50 ng/μL) 1.0 50 ng
DNA Sisipan (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA Ligase Buffer 2.0 1×
T4 DNA Ligase 1.0 400 U
Air Nuclease-free 15.67 Hingga 20 μL
Total Volume 20.0

Tips Optimasi

Berdasarkan parameter input Anda, berikut adalah beberapa rekomendasi:

  • Untuk ujung lengket 5' dengan rasio vektor:sisipan 1:3, inkubasi pada 16°C selama 4 jam.
  • Perlakuan CIP pada vektor akan membantu mengurangi latar belakang self-ligation.
  • Jika efisiensi transformasi rendah, coba tingkatkan rasio sisipan:vektor menjadi 5:1.
  • Untuk ligasi ujung tumpul, tingkatkan konsentrasi ligase dan perpanjang waktu ligasi.
  • Inaktivasi ligase dengan pemanasan pada 65°C selama 10 menit sebelum transformasi untuk hasil terbaik.

Tentang Ligation DNA

  • Ligation DNA melibatkan penggabungan fragmen DNA melalui pembentukan ikatan fosfodiester.
  • T4 DNA ligase memerlukan ATP dan Mg²⁺ untuk berfungsi dengan baik (disediakan dalam buffer ligasi).
  • Ligasi ujung lengket lebih efisien dibandingkan ligasi ujung tumpul.
  • Rasio molar vektor:sisipan biasanya berkisar antara 1:3 hingga 1:5 untuk kloning standar.
  • Rasio sisipan:vektor yang lebih tinggi (3:1 hingga 10:1) direkomendasikan untuk ligasi ujung tumpul atau sisipan yang lebih besar.
  • Dephosphorylation vektor (menggunakan CIP, SAP, dll.) mencegah self-ligation vektor.
  • Sistem ligase cepat dapat mengurangi waktu ligasi menjadi 5-15 menit pada suhu ruangan.

Formula untuk Jumlah Insert (ng):

\[ \text{Insert ng} = \left( \frac{\text{Vector ng} \times \text{Ukuran insert dalam kb}}{\text{Ukuran vector dalam kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Mole insert}}{\text{Mole vector}} \right) \]

Apa itu Kalkulator Ligation?

Kalkulator Ligation adalah alat yang membantu peneliti menentukan jumlah vector dan DNA insert yang tepat yang diperlukan untuk reaksi ligasi yang sukses. Ligasi DNA adalah langkah penting dalam kloning molekuler, di mana DNA insert digabungkan dengan vektor plasmid menggunakan enzim yang disebut DNA ligase.

Bagaimana Cara Kerjanya?

Kalkulator ini memungkinkan pengguna untuk memasukkan detail tentang vektor dan insert mereka, termasuk panjang dan konsentrasi. Berdasarkan rasio molar yang dipilih, kalkulator ini menghitung jumlah DNA insert yang diperlukan untuk mencapai reaksi ligasi yang optimal.

Fitur Utama

  • Menghitung rasio molar vektor terhadap insert untuk berbagai skenario kloning.
  • Mendukung baik rasio molar standar maupun kustom.
  • Memberikan rekomendasi untuk kondisi ligasi berdasarkan kloning ujung lengket atau tumpul.
  • Termasuk tips optimasi untuk meningkatkan efisiensi ligasi.

Bagaimana Cara Menggunakan Kalkulator

  1. Masukkan panjang vektor (bp) dan konsentrasi (ng/μL).
  2. Masukkan panjang insert (bp) dan konsentrasi (ng/μL).
  3. Pilih rasio molar vektor terhadap insert yang diinginkan (misalnya, 1:3, 1:5).
  4. Tentukan volume reaksi total (misalnya, 20 μL).
  5. Untuk pengaturan lanjutan, pilih suhu ligasi, durasi, jenis ligase, dan opsi perlakuan vektor.
  6. Klik “Hitung” untuk menghasilkan jumlah insert yang direkomendasikan dan pengaturan reaksi.

Pertanyaan yang Sering Diajukan

Apa rasio molar vektor terhadap insert yang optimal?

Untuk ligasi ujung lengket, rasio vektor terhadap insert 1:3 atau 1:5 umumnya direkomendasikan. Untuk ligasi ujung tumpul, rasio yang lebih tinggi (misalnya, 1:5 hingga 1:10) dapat meningkatkan efisiensi.

Mengapa dephosphorylation vektor direkomendasikan?

Dephosphorylation (menggunakan CIP, SAP, atau Phosphatase Antartika) mencegah ligasi diri vektor, mengurangi koloni latar belakang yang tidak diinginkan.

Kondisi ligasi apa yang harus saya gunakan?

  • 16°C selama 4 jam – Kondisi standar untuk T4 DNA ligase.
  • Suhu ruangan selama 15 menit – Cocok untuk Quick Ligase.
  • Semalaman di 16°C – Direkomendasikan untuk ligasi yang menantang atau kloning ujung tumpul.

Bagaimana saya bisa meningkatkan efisiensi ligasi?

  • Pastikan rasio molar yang benar untuk vektor dan insert.
  • Gunakan DNA ligase dan buffer yang segar.
  • Optimalkan kondisi ligasi (suhu dan durasi).
  • Konfirmasi keberadaan insert melalui elektroforesis gel sebelum ligasi.

Mengapa Menggunakan Kalkulator Ini?

Kalkulator Ligation ini menyederhanakan pengaturan reaksi ligasi DNA, membantu peneliti menentukan jumlah vektor dan insert yang tepat untuk kloning yang efisien. Dengan mengotomatiskan perhitungan dan menawarkan tips optimasi, kalkulator ini menghemat waktu dan meningkatkan tingkat keberhasilan eksperimen ligasi.